第一节 工具酶
DNA重组技术中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具，表20-列出最常用的几种工具酶。限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）在重组DNA技术中有重要地位，在此较详细介绍。
一、限制性核酸内切酶的概念
核酸酶可分为两类：核酸外切酶（exonuclease）是从核酸的一端开始，一个接一个把核苷酸水解下来；核酸内切酶(endonuclease)则从核酸链中间水解3’，5’磷酸二酯键，将核酸链切断。很多细菌和细胞中都能识别外来的核酸并将其分解，1962年发现这是因为细菌中含有特异的核酸内切酶,能识别特定的核酸序列而将核酸切断;同时又伴随有特定的核酸修饰酶,最常见的是甲基化酶,能使细胞自身核酸特定的序列上碱基甲基化,从而避免受内切酶水解,外来核酸没有这种特异的甲基化修饰,就会被细胞的核酸酶所水解.这样细胞就构成了限制一修饰体系,其功能就是保护自身的DNA,分解外来的DNA,以保护和维持自身遗传信息的稳定,这对细菌的生存和繁衍具有重要意义。这就是限制性核酸内切酶名称中“限制”二字概念的由来。
二、限制性核酸内切酶的命名
按酶的来源的属、种名而定，取属名的第一个字母与种名的头两个字母组成的三个斜体字母作略语表示；如有株名，再加上一个字母，其后再按发现的先后写上罗马数字。例如：从流感嗜血杆菌d株（Haemophilus influenzae d）中先后分离到3种限制酶，则分别命名为HindⅠ、HindⅡ和HindⅢ。
三、限制性核酸内切酶的分类
按限制酶的组成、与修饰酶活性关系，切断核酸的情况不同，分为三类：
Ⅰ类限制性核酸内切酶 由3种不同亚基构成，兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，去随机切断在识别位点以外的DNA序列，通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+，S腺苷甲硫氨酸及ATP。
Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似，是多亚蛋白质，既有内切酶活性，又有修饰酶活性，切断位点在识别序列周围25-30bp范围内，酶促反应除Mg2+外，也需要ATP供给能量。
Ⅲ类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成，仅需Mg2+，切割DNA特异性最强，且就在识别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。
表20-1 DNA重组技术中最常用的工具酶
| 酶 | 主要用途 |
| 限制性核酸内切酶 | 识别DNA特定序列，切断DNA链 |
| DNA聚合酶Ⅰ或其大片段（Klenow） | ①缺口平移制作标记DNA探针
②合成cDNA的第二链 ③填补双链DNA3’凹端 ④DNA序列分析 |
| 耐热DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶等） | 聚合酶链反应（PCR） |
| DNA连接酶 | 连接两个DNA分子或片段 |
| 多核苷酸激酶 | 催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化，制备末端标记探针 |
| 末端转移酶 | 在3’末端加入同质多聚物尾 |
| SI核酸酶，绿豆核酸酶 | 降解单链DNA或RNA，使双链DNA突出端变为平端 |
| DNA端酶Ⅰ | 降解DNA，在双链DNA上产生随机切口 |
| RNA酶A | 降解除RNA |
| 磷酸酶 | 切除核酸末端磷酸基 |
四、限制性核酸内切酶的作用
大部分限制性核酸内切酶识别DNA序列具有回文结构特征，切断的双链DNA都产生5’磷酸基和3’羟基末端。不同限制性核酸内切酶识别和切割的特异性不同，结果有三种不同的情况：
①产生3’突出粘性末端（cohesive end）:以Eoor 为例：
5’…G↓AATT C…3’→5’…Gp OHTTAAC…3’
3’…C ATAA↑G…5’EooP Ⅰ 3'… CTTAAOH pG…5'
②产生5’突出的粘性末端：以PstⅠ为例：
5’…CTGCA↓G…3’→5’…CTGCAp OHG…3’
3’…G↑ACGTC…5’PstⅠ 3’…GOH pACGTC…5
③产生平末端（blunt end）:Nru Ⅰ为例：
5’…TCG↓CGA…3’→5’…TCGp OHCGA…3’
3’…AGC↑GCT…5’Nru Ⅰ3’…AGCOhpGCT…5’
不同有限制性核酸内切酶识别的DNA序列可以不相同。有的识别四核苷酸序列，有的识别六或八核苷酸序列。如果DNA中的核苷酸序列是随机排列的，则一个识别四核苷酸序列的内切酶平均每隔256bp出现一次该酶的识别切割位点，同样的对识别六或八核苷酸序列的内切酶则大致上分别是每隔4kb或65kb出现一次识别切割位点。按此可大致估计一个未知的DNA分子限制性内切酶可能具有切点频率，以便选用合适的内切酶。
限制性核酸内切酶的种类很多，至今已发现近800多种，可以根据它们对DNA有不同的识别序列和切割特征选用，从而为基因工程提供了有力的工具。表20-2列出了几种最常用的限制性核酸内切酶的识别序列和切割点。
表20－2 几种最常用的限制性核酸内切酶
| 限制性核酸内切酶名称 | 识别序列和切割点 |
| BamHⅠ
Cla Ⅰ EooR Ⅰ Hind Ⅲ HindⅡ KpnⅠ Not Ⅰ Pst Ⅰ Sal Ⅰ Sau3A Ⅰ Sfi Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ | G↓GATCc
AT↓CGAT G↓AATTC A↓AGCTT GTPy↓PuAC GGTAC↓C GC↓GGCCGC CTGCA↓G G↓TCGAC ↓GATC GGCCNNNN↓NGGCC CCC↓GGG T↓CTAGA C↓TCGAG |
